La fase oscura, detta Ciclo di Calvin-Benson, porta all'organicazione di 6CO2 in una molecola di C6H12O6 e viene rigenerato l'ATP e il NADPH che ha rilasciato la sua energia. Il ciclo si svolge nello stroma dei cloroplasti utilizzando i composti energetici prodotti nella fase luminosa.
Nell'equazione è stato omesso il RuBP, presente nei reagenti e nei prodotti.
In ciascun giro del ciclo è incorporata una sola molecola di CO2, perciò servono 6 giri per produrre una molecola di glucosio.
Fase di carbossilazione. 6 molecole di CO2 (1C) si uniscono a 6 molecole a 5 atomi di C, il ribulosio 1,5-difosfato (RuBP) con l'intervento di un enzima chiamato rubisco (ribulosio difosfato carbossilasi) e si ottengono 6 molecole di un intermedio instabile a 6C che si scinde immediatamente in 6x2 molecole a 3C di acido 3-fosfoglicerico (3PGA). L'idrolisi dell'intermedio richiede 6H2O.
Fase di riduzione. L'acido 3-fosfoglicerico (3PGA), con l'intervento di 12ATP originati nella fase luminosa, è trasformato in 12 molecole di acido 1,3-difosfoglicerico (DPGA), sempre a 3C che, a sua volta, è ridotto da 12NADPH, prodotti nella fase luminosa, in 12 molecole di 3-fosfogliceraldeide (G3P=PGAL) a 3C, composto ad elevato contenuto energetico. Si perde un gruppo fosfato per molecola e si liberano 6H2O.
Fase di conversione in glucosio. 2 molecole di 3-fosfogliceraldeide escono dal ciclo e, poiché sono anche un intermedio della glicolisi, con una serie di reazioni uguali alla glicolisi, ma in senso inverso, formano una molecola di glucosio oppure sono impiegate nella costruzione di altre molecole organiche come il glicerolo, acidi grassi, amminoacidi.
Fase di ripristino. Le restanti 10 molecole di PGAL sono riorganizzate, attraverso una serie di reazioni, in 6 molecole di ribulosio 5-fosfato (5C) e, con l'impiego di 6ATP, si rigenerano 6 molecole di RuBP.
Il prodotto finale che esce dal ciclo di Calvin è dunque il PGAL. Una parte di queste molecole è trasformata in saccarosio e poi, mediante idrolisi, in glucosio e fruttosio, molecole che rappresentano la base per la sintesi di amminoacidi, lipidi e acidi nucleici. Un'altra parte diventa amido, polisaccaride di riserva mentre una quota è trasformata in acido piruvico che entra nella respirazione cellulare. Il PGAL, infatti, è composto comune di fotosintesi e respirazione.
